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质膜的液态二相离心分离
发布时间:2011-07-08   点击次数:943次
用葡聚糖(Dextran)和聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)二相不连续梯度分离纯化动植物样品的细胞膜片断(特别是质膜)的方法始于1989年(文献1)。这种方法的特点是快速,操作简单,重复性好。只需要低速离心机(4,000rpm),分离成本低。
用PEG和Dextran 混合后再加入样品,低速离心后形成上下二个液体相,体积相近。上液体相中对于动物细胞的亚细胞构造的排列,顺序是(自下而上),内质网<线粒体<溶酶体<高尔基体<质膜;对于植物细胞其排列顺序(自下而上)是:破碎的类囊体<完整的叶绿体<糙面内质网<线粒体,过氧化酶体<液泡膜<滑面内质网<类囊体<高尔基体<溶酶体<质膜。
 
常用的方法是:组织匀浆先以低速离心(甩平转头,500g,3min)去除没有破碎的整细胞及其他组织碎片。上清液与Dextran 及PEG 混合后再低速离心(3,000xg,15min)形成二个液体相。
 
离心方案:
1. 原液制备:
   Dextran (20%w/w):220克 Dextran T-500 (Pharmacia 产品) 溶于780克纯水,电磁搅拌器加热(40℃)并搅拌至全部溶解。
   PEG(3350,Union Carbide 公司出品,或相应产品)300克溶于1升水。
2. 制备液体二相:取200克,20% Dextran ,103克PEG原液,33ml 0.2M Na3PO4 (PH6.5)和179ml 纯水在量筒中充分混合,静置过夜形成二相液体,PEG在上,Dextran 在下。可以看到明显的分界面,中间有较窄的隔离带。分别取出二液态相备用(Dextran下相包含隔离带)
3. 用合适的方法将含有107--108 个细胞的动、植物组织制备成匀浆,用低速小型冷冻离心机水平转头(如Hitachi CF-RX 系列离心机,T5SS31 甩平转头或 CF-7D2 离心机T5SS 转头,zui大容量 4×250ml 单管容量从5ml 到 250ml,用户可按实际情况选用不同容量的离心管。也可以用其他品牌离心机和相应的转头)
4. 匀浆在500g (约1,600rpm)4℃离心3分钟去除没有裂解的细胞和组织(在沉淀中)
5. *次离心后的上清液在3,000xg (约4,100rpm)4℃ 离心15分钟,保留沉淀。
6. 将第二次离心后的沉淀加入尚未形成二相的Dextran--PEG 混合液(第2步前段),充分混合。2,000xg(约3,300rpm), 4℃离心10分钟。离心后仍保持4℃。等待形成明显的二个液态相(有隔离带),亚细胞构造分布于二个液态相之中。
7. 分别收集(6) 离心后形成的二个含有亚细胞构造的液态相备用(上相和下相,下相包含隔离带)
8. 根据容量选择合适的离心管(常用50ml 带盖圆底管),*类离心管下部是(2)中形成的Dextean液态相和隔离带;上部是(7)中用水稀释(3—5倍)的上相。上、下部体积比为6:4。
9. 第二类离心管下部是(7)中离心后的下相(包含隔离带),上部是(2)中制备的PEG液态相,上、下部液体的比例为4:6
10. 以上二类离心管,分别用上下颠倒30—40次的方法充分混合后分别离心(3,000xg,约4,100rpm,4℃,10分钟)
11. *类离心管离心后上部液态相中主要含质膜片断,下部为其他亚细胞构造
12. 第二类离心管离心后上部及隔离带中主要含质膜片断,下部为其他亚细胞构造
 
讨论:
1. 不同的组织,分离质膜的离心转速和时间及PH值各有差异,可以从实验中摸索,优化。
2. 离心后其他亚细胞构造可以用文献中介绍的其他方法进一步分离纯化(例如用Percoll,Nycodenz,metrizamide作自形成梯度分离)
 
参考文献:
1. Fisher. D. and Sutherland, I.A.  “Separations using aqueous phase system”—Applicaion In cell biology and biotechnology . plenum press , New York .1989
2. W . Howard  Evans  “Isolation and characterization of membranes and cell organelles”, from “Centrifugation” Edited by David Rickwood,Oxford  Univ. press 1992
3. Presson  A. 等      Biochem . J .  vol:273  P173 (1991)
注:本文主要内容摘自文献(2)

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