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质粒DNA分离方法比较
发布时间:2011-08-15   点击次数:1263次

 

发酵后的E.Coli培养液

用低速大容量冷冻离心机,大容量甩平或角式转头(3000~6000rpm,30~15min)或高速连续流转头(10000~18000rpm,流量300~600ml/min)

E.Coli菌体沉淀

用溶菌酶破细胞壁

用表面活性剂破细胞膜(如Triton X-100,SDS等)

大部分染色体DNA粘附在膜蛋白上,用一定浓度的盐溶液(如1 mol NaCl 或1 mol 醋酸钠)溶解后台式高速离心机(Eppendorf管10000rpm,10min)或高速冷冻离心机10000~12000rpm×10min,上清中大部分为染色体DNA,沉淀中含质粒DNA,降解的质粒DNA,RNA及蛋白质

 

在沉淀中加入异丙醇得到粗制的质粒DNA

 

沉淀中加入TE缓冲液(pH8.0)

 

粗制DNA在-20℃在重力状态喜爱沉淀15min以上,高速离心机12000rpm(近15000g)4℃离心5min去上清

 

用苯酚抽提去蛋白质或用分子筛去蛋白质

 

用RNA酶降解RNA

真空中抽去异丙醇,溶液中加入TE缓冲液

 

 

过柱(聚丙烯酰胺)RNA留柱,质粒DNA过柱

加入E.B及Triton X-100,在CsCl中(预制梯度或平衡等密度离心,自形成梯度)用角转头,近垂直转头做超速离心(见文献10)

 

 

较纯的质粒DNA,但含有5~10%的染色体DNA和降解的DNA片段

剩余的蛋白质上浮,RNA沉淀,染色体DNA在离心管中上部形成区带,质粒DNA在离心管中下部形成纯样品区带

 

 

 

 

密度梯度仪或其他简易方法从离心管中抽出,经过带流动池的分光光度计后分部收集,从吸光度峰可以判断质粒DNA所在的位置

 

 

 

 

去CsCl,去其他组分得到高纯度质粒DNA

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