发酵后的E.Coli培养液 |
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用低速大容量冷冻离心机，大容量甩平或角式转头（3000~6000rpm,30~15min）或高速连续流转头（10000～18000rpm，流量300～600ml/min） |
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E.Coli菌体沉淀 |
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用溶菌酶破细胞壁 |
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用表面活性剂破细胞膜（如Triton X-100，SDS等） |
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大部分染色体DNA粘附在膜蛋白上，用一定浓度的盐溶液（如1 mol NaCl 或1 mol 醋酸钠）溶解后台式高速离心机（Eppendorf管10000rpm，10min）或高速冷冻离心机10000～12000rpm×10min，上清中大部分为染色体DNA，沉淀中含质粒DNA，降解的质粒DNA，RNA及蛋白质 |
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在沉淀中加入异丙醇得到粗制的质粒DNA |
| 沉淀中加入TE缓冲液（pH8.0） |
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粗制DNA在-20℃在重力状态喜爱沉淀15min以上，高速离心机12000rpm（近15000g）4℃离心5min去上清 |
| 用苯酚抽提去蛋白质或用分子筛去蛋白质
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| 用RNA酶降解RNA |
真空中抽去异丙醇，溶液中加入TE缓冲液 |
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| 过柱（聚丙烯酰胺）RNA留柱，质粒DNA过柱 |
加入E.B及Triton X-100,在CsCl中（预制梯度或平衡等密度离心，自形成梯度）用角转头，近垂直转头做超速离心（见文献10） |
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| 较纯的质粒DNA，但含有5～10%的染色体DNA和降解的DNA片段 |
剩余的蛋白质上浮，RNA沉淀，染色体DNA在离心管中上部形成区带，质粒DNA在离心管中下部形成纯样品区带 |
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密度梯度仪或其他简易方法从离心管中抽出，经过带流动池的分光光度计后分部收集，从吸光度峰可以判断质粒DNA所在的位置 |
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去CsCl，去其他组分得到高纯度质粒DNA | ||
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